Köpeklerde Vektör Kaynaklı Bazı Patojenlerin Teşhisine Yönelik LAMP Tabanlı Moleküler Teşhis Panelinin Geliştirilmesi ve Epidemiyolojik Değerlendirilmesi

Proje Özeti

Sunulan proje, proje yürütücüsünün veteriner parazitoloji ve moleküler tanı alanındaki akademik yetkinliğini geliştirmeye ve bağımsız araştırmacı kimliğini güçlendirmeye yönelik bir kariyer geliştirme potansiyeline sahiptir. Proje yürütücüsünün doktora çalışması kapsamında edindiği vektör kaynaklı patojenlerin moleküler tanısı ve epidemiyolojisine ilişkin deneyimin, bu proje aracılığıyla yeni bir tanı yaklaşımına uyarlanması hedeflenmektedir. Proje sürecinde elde edilecek bilimsel çıktılar, yürütücünün ulusal ve uluslararası yayın performansını destekleyecek; aynı zamanda lisansüstü öğrencilerin yetiştirilmesine ve araştırma altyapısının güçlendirilmesine katkı sağlayacaktır. Projenin özgün değeri, köpeklerde yaygın olarak görülen vektör kaynaklı patojenlerin (Hepatozoon canis, Hepatozoon sp. MF, Mycoplasma haemocanis, Candidatus Mycoplasma haematoparvum, Ehrlichia canis ile Babesia canis grubundan Babesia canis canis, B. canis vogeli ve B. canis rossi) tanısına yönelik olarak, saha koşullarında uygulanabilir kolorimetrik LAMP tabanlı çoklu bir moleküler teşhis panelinin geliştirilmesini amaçlamasından kaynaklanmaktadır. Literatürde bu patojenlerin tanısında PCR ve real-time PCR gibi yöntemler yaygın olarak kullanılmakla birlikte, bu yöntemlerin yüksek maliyet ve teknik altyapı gereksinimleri nedeniyle rutin saha uygulamalarında sınırlı seviyede kullanıldığı bilinmektedir. Bu proje ile hedef patojenler için BLAST analizi ile doğrulanmış primer setlerinin geliştirilerek optimize edilmesi amaçlanmaktadır. Yöntemsel olarak proje ile izotermal amplifikasyon temelli kolorimetrik LAMP yaklaşımının tanısal avantajlarından (yüksek sensitivite ve spesifite) yararlanma öngörülmektedir. Çalışma kapsamında, seçilmiş patojenler için uygun hedef gen bölgeleri literatür ve veri tabanı analizleri doğrultusunda belirlenecek; her bir patojene spesifik LAMP primerleri tasarlanarak reaksiyon koşulları optimize edilecektir. Geliştirilecek LAMP protokollerinin sensitivite ve spesifiteleri belirlenecektir. Ayrıca her bir patojen özelinde LAMP teşhis panelinin DNA tespit limitlerinin belirlenmesi ve örnekler içerisinde saptanabilen en düşük DNA miktarının ortaya konması hedeflenmektedir. Bu yaklaşım, geliştirilen yöntemlerin subklinik enfeksiyonlar ve düşük patojen yükü taşıyan örneklerdeki tanısal performansının değerlendirilmesine olanak sağlayacaktır. Bu proje kapsamında geliştirilmesi ve optimizasyonunun yapılması planlanan kolorimetrik LAMP teşhis paneli kullanılarak, farklı coğrafi bölgelerden (İstanbul, Ankara ve İzmir) toplanacak köpek kan örneklerinden elde edilecek verilerin epidemiyolojik açıdan değerlendirilmesi de amaçlanmaktadır. Bu amaçla Türkiye’nin farklı iklimsel ve coğrafi özelliklerini temsil eden ve insan ile köpek popülasyon yoğunluğunun yüksek olduğu İstanbul (n=204), Ankara (n=115) ve İzmir (n=137) illerinden toplam 456 sahipli köpekten kan örneği temin edilecektir. Örneklem sayısı, her bir ildeki sahipli köpek sayıları dikkate alınarak OpenEpi Version 3 (open source calculator—SSPropor) yazılımı aracılığıyla belirlenmiştir. Elde edilen kan örneklerinden DNA izolasyonu gerçekleştirilecek; izole edilen DNA’lar proje kapsamında geliştirilecek olan LAMP teşhis paneli ve PCR yöntemleri ile analiz edilecek ve elde edilen bulgular kayıt altına alınacaktır. Projenin yönetimi, tanımlanmış iş paketleri ve gerçekçi bir zaman planı çerçevesinde yürütülecektir. Numune temini, laboratuvar çalışmaları, veri analizi ve raporlama aşamaları arasında koordinasyon sağlanarak sürecin düzenli ilerlemesi amaçlanmaktadır. Olası teknik aksaklıklar ve riskler önceden öngörülmüş olup, gerekli durumlarda alternatif yöntemlerin devreye alınması planlanmıştır. Projenin yaygın etkileri ise, i) köpeklerde enfeksiyona neden olan vektör kaynaklı patojenlerin teşhisinde kullanılmak üzere LAMP teşhis paneli geliştirilmesi, panelin optimizasyonunun yapılarak rutin kullanıma hazır hale getirilmesi, ii) Türkiye’nin farklı bölgelerinde köpeklerde sirküle olan vektör kaynaklı önemli patojenlerden bazılarının epidemiyolojilerine ilişkin güncel verilerin elde edilecek olması, iii) proje sürecinde ve sonrasında elde edilen verilerin bir araya getirilerek uluslararası etki faktörü yüksek dergilerde bilimsel çıktı haline getirilecek olması, iv) proje süresince Anabilim Dalımızda eğitim gören lisansüstü öğrencilerin çalışmalara katılarak moleküler alanda kendilerini geliştirmelerine ve Türkiye’nin eğitimli insan gücüne katkı sağlanacak olması, şeklinde sıralanabilmektedir. Yukarıdaki bilgiler bir araya getirildiğinde projenin hem yaygın etkisinin hem de özgünlüğünün yüksek olduğu değerlendirilmektedir.