Nauphoeta cinera (OLIVIER, 1789) (BLATTODEA, BLABERIDAE) TÜRÜNDE GERÇEK ZAMANLI RT-qPCR İLE KANTİTATİF EKSPRESYON ANALİZİ İÇİN REFERANS GENLERİN TANIMLANMASI VE DOĞRULANMASI

---

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Sivas Cumhuriyet Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2022

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: KÜBRA ÖZCAN

Danışman: Şeyda Berk

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Gen ekspresyon çalışmalarında farklı deneysel veya klinik koşullar altında genlerin ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması için kullanılan en yaygın teknik Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-qPCR)'dur. RT-qPCR'da güvenilir sonuçlar elde etmek için verilerin housekeeping genler (HKG) (referans genler) ile normalizasyonunun yapılması gerekmektedir. Delta-delta Ct yöntemi gibi gen ekspresyonunun hesaplanması için, PCR primer verimliliğinin ilgili gen ve housekeeping geni için karşılaştırılabilir olduğu varsayılmaktadır. Farklı PCR primer verimlilikleri (E) sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, veri normalizasyonu için uygun bir referans genin tanımlanması, qPCR deneylerinin geliştirilmesinde önemli bir adımdır. Bununla birlikte; çalışma tasarımına uygun en stabil HKG'in kullanılması, çalışma sonuçlarının güvenilirliğini artırmaktadır. Güvenilir veri elde etmek için çalışma tasarımına uygun stabil HKG'in seçimi ve validasyonu önemli bir adımdır ki bu ekspresyon bazlı çalışmalarda bütünleyici bir adım olmuştur. HKG seçimi için farklı yazılım programları geliştirilmiştir. Normalizasyon için seçilecek en stabil HKG'in seçilmeden önce deneysel çalışmalar ile dikkatli bir şekilde değerlendirmesinin yapılması gerekmektedir. N. cinerea lobster hamam böceği cinsel seçilim, bakteriyel enfeksiyonlar, toksiloji çalışmaları ve metabolik hız ile uyum çalışmaları arasındaki korelasyonlar için model olarak kullanılan türdür. Bu çalışmada altı aday referans gen ACTB (Beta-aktin), RPS18 (40S Ribozomal protein S18), EF1α (Uzama faktörü 1-alfa), α-Tub (α-Tubulin), ArgK ix (Arginine kinaz) ve GADPH (Gliseraldehit-3-fosfat) RT-qPCR analizi için aday olarak seçilmiştir. Bu adayların ifade profillerinin kararlılığı geNorm, NormFinder, BestKeeper, ΔCt ve RefFinder yöntemi ile analiz edilmiştir. Sonuçlarımız, α-Tub geninin N. cinerea erişkinlerinde gen ekspresyon seviyelerinin doğru normalizasyonu için en satabil gen olduğunu göstermiştir. Ayrıca, GADPH'ın ikinci en stabil referans gen olduğu saptanmıştır. Nauphoeta cinera türünde RT-qPCR analizi için referans gen tanımlanması, doğrulanması ve ekpresyon gen stabilitesinin saptanması ile ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, sonuçlar hamamböceklerinde q-RT-PCR çalışmalarında biyotik ve abiyotik koşullar altında referans genlerin doğrulanması ihtiyacını vurgulamaktadır.